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免疫电镜胶体金标记方法及操做(仅供参考)
点击次数:5119 发布时间:2012-07-11

 免疫电镜是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质,使其与抗体相吸附,从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时,在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色,不需加外进行染色。在电镜水平,金颗粒具有很高的电子密度,清晰可辨。因此,免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面,并取得了长足的进展,解决了一些过去未能解决的问题,80年代以来似有取代免疫电镜PAP技术的趋势。胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点:而 PAP法则烦琐的多,胶体金法不需用H2O2等损伤微细结构的处理步骤,对微细结构的影响较少。其次,金颗粒具有很高的电子密度,在电镜下金颗粒清晰可辨,易于与其他免疫产物相区别。
    因此,金标法还可以和PAP法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。另外,利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体,是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。金标抗体还可加入培养液中,对培养细胞内抗原进行标记定位。曾有报告用金标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。由于金具有强烈的继发电子的能力,因此,不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察,也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。金标液无毒性,对人体无损伤。 在原位分子杂交技术在电镜水平的应用中,胶体金的标记术被科技工作者认为是当前的标记物。
                电镜水平的免疫金染色法
    应用于电镜水平的免疫法,可分为包埋前染色和包埋后染色,由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差,一般只用于细胞表面的抗原标记,如需穿透细胞膜,则需辅以冻融法或加入Triton X—100、皂素等活性剂,后者会加重细胞超微结构的破坏,因此,现较普遍采用包埋后染色,现分别介绍如下:
    1.包埋后染色
(1)超薄切片厚50~70nm左右,载于200~300网孔的镍网上。
(2)置1%H2O2内10min至1h(视树脂的硬度和切片的厚度而定),以去锇酸和增进树脂穿透性,有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时,此步可省略。操作时,滴入1%H2O2液1滴于蜡板上,将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片,有主张以1%过碘酸钾(KIO4)代替H2O2的。
(3)双蒸水洗3次,每次10min,第1,2次洗法如(2),浮于液滴上,第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗,水流应有适当压力,但不宜过高强,用滤纸在网缘将水吸干。
(4)浮于正常羊血清(1:50~1:100)滴上,室温30~60min,以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位。
(5)PBS漂洗3min,洗1次(有人主张不洗)。
(6)滤纸吸干,孵育于*抗体血清滴上,先室温预孵1h,再置于4℃ 24~36h。
(7)PBS漂洗3min,3次。
(8)PBS(内含1%的牛血清白蛋白)pH8.2中,5min,此步为胶体金结合作准备。
(9)胶体金标记抗体液1:30~1:100,淡红色为适宜稀释液,室温孵育10min至1h。
(10)双蒸水洗3min,3次。
如作双重染色,则应将镍网翻过来,用另一类抗体血清,重复上述步骤(2)~(10)。
(11)5%醋酸铀(双蒸水配制)染5min,然后用双蒸水洗。
(12)枸橼酸铀(或醋酸铅)染色5min,双蒸水洗净。
(13)电镜观察。

    2.包埋前染色
(1)组织经过适当固定,为增强细胞穿透性,可在固定液中加入皂角素(Saponin),使其浓度为0.01%,经含皂角认固定剂处理5~8min后,应用0.01mol/L PBS Ph7.4冲洗12h左右,中间换洗3~4次。
(2)组织切片贴于明胶涂抹的坡片上,细胞可制成混悬液,用离心法操作或制成涂片。
(3)0.05mol/L PBS pH7.4洗3min。
(4)以1:5正常羊血清处理切片30min室温,以阻断非特异性吸附。
(5)*抗体4℃孵育20h后室温2h或过夜。
(6)0.05mol/L TBS pH7.4洗3min×3。
(7)0.02mol/L TBS pH8.2洗3min×3,为与胶体金结合作准备。
(8)再次阻断非特异性吸附,同(4)。
(9)以金标记的第二抗体(工作浓度1:40左右)在室温下孵育1h。
(10)0.05mol/L TBS pH8.2洗3min。
(11)0.05mol/L TBS pH7.4洗3min×3
(12)1%锇酸(0.1mol/L PBS溶液)1h。
(13)双蒸水洗15min。
(14)系列酒精或丙酮脱水,包埋、超薄切片。(15)枸椽酸铅对照染色。
 为增加抗非特异性染色,有的实验室倾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma)。理想的免疫金染色切片,背景应清洁,无残留的金或其他无机盐颗粒,金粒集中在抗原、抗体反应部位。要获得理想的免疫金染色切片,需注意的因素很多,其中主要的如:①抗体血清的高度特异性和亲和力;②被检组织应有较高浓度的抗原;③冲洗液的清洁度,冲洗的*程度以及整个过程中应用的各种器皿的清洁度等;④所有溶液用微孔滤过器(milipore filter滤过),滤膜孔径0.2~0.45μm,所有器皿应清洁和。整个操作过程应在湿盒内进行,以使载网保持湿润。

 

 
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